Abstract Objective The aim of the present study was to evaluate the current practice of using of methylprednisolone sodium succinate (MPSS) in acute spinal cord Injuries (ASCIs) among spine surgeons from Iberolatinoamerican countries. Methods A descriptive cross-sectional study design as a survey was conducted. A questionnaire composed of 2 sections, one on demographic data regarding the surgeons and MPSS administration, was sent by email to members of the Sociedad Ibero Latinoamericana de Columna (SILACO, in the Spanish acronym) and associated societies. Results A total of 182 surgeons participated in the study: 65.4% (119) orthopedic surgeons and 24.6% (63) neurosurgeons. Sixty-nine (37.9%) used MPSS in the initial management of ASCIs. There were no significant differences between countries (p = 0.451), specialty (p = 0.352), or surgeon seniority (p = 0.652) for the use of corticosteroids in the initial management of ASCIs. Forty-five (65.2%) respondents reported using an initial high-dose bolus (30 mg/Kg) followed by a perfusion (5.4 mg/ kg/h). Forty-six (66.7%) surgeons who used MPSS only prescribed it if the patients presented within 8 hours of the ASCI. Most of the surgeons (50.7% [35]) administered high-dose corticosteroids because of the conviction that it has clinal benefits and improves neurological recovery. Conclusion Results from the present survey show that MPSS use in ASCI is not widespread within spine surgeons and that the controversy regarding its use remains unresolved. This is probably due to the low level of evidence of the available data, to variations over the years, to inconsistencies in acute care protocols, and to health service pathways.

Resumo Objetivo O objetivo do presente estudo foi avaliar a prática atual de uso do succinato sódico de metilprednisolona (MPSS, na sigla em inglês) nas lesões agudas da medula espinal (LAMEs) entre cirurgiões de coluna de países ibero-americanos. Métodos Um estudo transversal descritivo foi realizado. O questionário continha duas seções, uma sobre os dados demográficos dos cirurgiões e acerca da administração de MPSS, e foi enviado por correio eletrônico aos membros da Sociedad Ibero Latinoamericana de Columna (SILACO, na sigla em espanhol) e sociedades associadas. Resultados No total, 182 cirurgiões participaram do estudo: 65,4% (119) eram cirurgiões ortopédicos e 24,6% (63), neurocirurgiões. Sessenta e nove (37,9%) usaram MPSS no tratamento inicial da LAME. Não houve diferenças significativas entre países (p = 0,451), especialidades (p = 0,352) ou senioridade do cirurgião (p =0,652) em relação ao uso de corticosteroides no tratamento inicial da LAME. Destes, 45 (65,2%) relataram a administração de um bolus de alta dose (30 mg/kg) seguido por perfusão (5,4 mg/kg/h). Quarenta e seis (66,7%) dos cirurgiões que usam MPSS apenas o prescrevem a pacientes tratados nas primeiras 8 horas após a LAME. A maioria dos cirurgiões (50,7% [35]) administrou corticosteroides em alta dose devido à convicção de seus benefícios clínicos e melhora da recuperação neurológica. Conclusão Os resultados do presente questionário mostram que o uso de MPSS na LAME não está disseminado entre os cirurgiões de coluna e que a controvérsia sobre sua administração ainda não foi resolvida. É provável que isto se deva ao baixo nível de evidência dos dados existentes, a variações ao longo dos anos, a inconsistências nos protocolos terapêuticos agudo e a diferentes sistemas de saúde.

Abstract Objective The objective of the present study was to evaluate the current practice in terms of timing to surgery in acute spinal cord injury (ASCI) patients among spinal surgeons from Iberolatinoamerican countries. Methods A descriptive cross-sectional study design as a questionnaire was sent by an email for all members of the Sociedad Ibero Latinoamericana de Columna (SILACO, in the Spanish acronym) and associated societies. Results A total of 162 surgeons answered questions related to the timing for surgery. Sixty-eight (42.0%) considered that ASCI with complete neurology injury should be treated within 12 hours, 54(33.3%) performed early decompression within 24 hours, and 40 (24,7%) until the first 48 hours. Regarding ASCI with incomplete neurological injury, 115 (71.0%) would operate in the first 12 hours. There was a significant difference in the proportion of surgeons that would operate ASCI within ≤ 24 hours, regarding the type of injury (complete injury:122 versus incomplete injury:155; p<0.01). In the case of patients with central cord syndrome without radiological evidence of instability, 152 surgeons (93.8%) would perform surgical decompression: 1 (0.6%) in the first 12 hours, 63 (38.9%) in 24 hours, 4 (2.5%) in 48 hours, 66 (40.7%) in the initial hospital stay, and 18 (11.1%) after neurologic stabilization. Conclusion All inquired surgeons favour early decompression, with the majority performing surgery in the first 24 hours. Decompression is performed earlier in cases of incomplete than in complete injuries. In cases of central cord syndrome without radiological evidence of instability, there is a tendency towards early surgical decompression, but the timing is still extremely variable. Future studies are needed to identify the ideal timing for decompression of this subset of ASCI patients.

Resumo Objetivo O objetivo do presente estudo foi avaliar a prática atual em termos de momento de realização da cirurgia em pacientes com lesão medularaguda (LMA) entre cirurgiões de coluna de países ibero-americanos. Métodos Estudo transversal descritivo com base em um questionário enviado por correio eletrônico para todos os membros da Sociedad Ibero Latinoamericana de Columna (SILACO, na sigla em espanhol) e sociedades associadas. Resultados Um total de 162 cirurgiões responderam a perguntas relacionadas ao momento da cirurgia. Sessenta e oito (42,0%) consideraram que a LMA com lesão neurológica completa deve ser tratada em até 12 horas, 54 (33,3%) realizariam a descompressão precoce em até 24 horas e 40 (24,7%) fariam este procedimento nas primeiras 48 horas. Em relação à LMA com lesão neurológica incompleta, 115 (71,0%) operariam nas primeiras 12 horas. Houve diferença significativa na proporção de cirurgiões que fariam o tratamento cirúrgico da LMA em ≤ 24 horas quanto ao tipo de lesão (lesão completa [122] versus lesão incompleta [155]; p<0.01). Em pacientes com síndrome medular central sem evidência radiológica de instabilidade, 152 cirurgiões (93,8%) realizariam a descompressão cirúrgica: 1 (0,6%) nas primeiras 12 horas, 63 (38,9%) em 24 horas, 4 (2,5%) em 48 horas, 66 (40,7%) no internamento inicial e 18 (11,1%) após a estabilização neurológica. Conclusão Todos os cirurgiões participantes favoreceram a descompressão precoce; a grande maioria realizaria a cirurgia nas primeiras 24 horas. A descompressão é feita antes em casos de lesões incompletas do que em lesões completas. Nos casos de síndrome medular central sem evidência radiológica de instabilidade, há uma tendência à descompressão cirúrgica precoce, mas o momento de intervenção ainda é extremamente variável. Estudos futuros são necessários para identificar o momento ideal para descompressão neste subconjunto de pacientes com LMA.

Abstract Objective The present study aims to evaluate the screw length and trajectory angles for posterior atlantoaxial fixation in a Portuguese population, through the study of cervical computed tomography (CT) scans. Methods Cervical CT scans of 50 adults were measured according to predefined screw trajectories of C1-C2 transarticular (C1C2TA), C1 lateral mass (C1LM), C2 pedicle (C2P), C2 pars and C2 laminar (C2L) screws. For each of these trajectories, screw length and angles were measured and compared between males and females. Results For the C1C2TA screw trajectory, the mean length, medial, and cranial angles were 34.12 ± 3.19 mm, 6.24° ± 3.06, and 59.25° ± 5.68, respectively, and for the C1LM screw trajectory, they were 27.12 ± 2.15 mm, 15.82° ± 5.07, and 13.53° ± 4.80, respectively. The mean length, medial, and cranial angles for the C2P screw trajectory were 23.44 ± 2.49 mm, 27.40° ± 4.88, and 30.41° ± 7.27, respectively; and for the C2 pars screw trajectory, they were 16.84 ± 2.08 mm, 20.09° ± 6.83, and 47.53° ± 6,97. The mean length, lateral, and cranial angles for the C2L screw trajectory were 29.10 ± 2.48 mm, 49.80° ± 4.71, and 21.56° ± 7.76, respectively. There were no gender differences except for the lengths of the C1C2TA (p= 0,020) and C2L (p= 0,001) screws, which were greater in males than in females. Conclusion The present study provides anatomical references for the posterior atlantoaxial fixation in a Portuguese population. These detailed data are essential to aid spine surgeons to achieve safe and effective screw placement.

Resumo Objetivo O presente estudo tem como objetivo avaliar o comprimento e os ângulos de trajetória do parafuso para fixação atlantoaxial posterior em uma população portuguesa por meio do estudo de tomografia computadorizada (TC) cervical. Métodos Tomografias computadorizadas cervicais de 50 adultos foram analisadas quanto às trajetórias pré-definidas dos parafusos transarticulares C1-C2 (C1C2TA), na massa lateral de C1 (C1LM), no pedículo de C2 (C2P) e na pars de C2 e C2 laminar (C2L). O comprimento e os ângulos dos parafusos em cada uma destas trajetórias foram medidos e comparados entre homens e mulheres. Resultados O comprimento médio e ângulos medial e cranial da trajetória do parafuso C1C2TA foram de 34,12 ± 3,19 mm, 6,24° ± 3,06 e 59,25° ± 5,68, respectivamente; as medidas da trajetória do parafuso C1LM foram 27,12 ± 2,15 mm, 15,82° ± 5,07 e 13,53° ± 4,80. O comprimento médio e os ângulos medial e cranial da trajetória do parafuso C2P foram de 23,44 ± 2,49 mm, 27,40° ± 4,88 e 30,41° ± 7,27, respectivamente; as medidas da trajetória do parafuso da pars de C2 foram 16,84 ± 2,08 mm, 20,09° ± 6,83 e 47,53° ± 6,97. O comprimento médio e ângulos lateral e cranial da trajetória do parafuso C2L foram de 29,10 ± 2,48 mm, 49,80° ± 4,71 e 21,56° ± 7,76, respectivamente. Não houve diferenças entre os gêneros, à exceção do comprimento dos parafusos C1C2TA (p= 0,020) e C2L (p= 0,001), que foi maior no sexo masculino do que no feminino. Conclusão O presente estudo fornece referências anatômicas para a fixação atlantoaxial posterior em uma população portuguesa. Estes dados detalhados são essenciais para ajudar os cirurgiões de coluna a colocar os parafusos de maneira segura e eficaz.

Abstract Objective The aim of this study was to assess the sacropelvic anthropometry in the Portuguese population, through the study of pelvic computed tomography (CT) scans. Methods Pelvic CT scans of 40 individuals were analyzed, and the length and angle measurements were performed according to predefined screw trajectories of S1 anterior (S1A), anterolateral (S1AL) and anteromedial (S1AM), S2 anterolateral (S2AL) and anteromedial (S2AM), S2 alar iliac (S2AI), iliac, and sacroiliac (SI) screws. Comparisons between genders were also performed. Results The S1A screw trajectory mean length was 30.80 mm. The S1AL mean length and lateral angle were 36.48 mm and 33.13°, respectively, and the S1AM's were 46.23 mm and 33.21°. The S2AL mean length was 28.66 mm and lateral angle was 26.52°, and the S2AM length and angle were 29.99 mm and 33.61°, respectively. The S2 alar-iliac screw trajectory mean length, lateral, and caudal angles were 125.84 mm, 36.78°, and 28.66°, respectively. The iliac screw trajectory mean length, lateral, and caudal angles were 136.73 mm, 23,86° and 24.01°, respectively. The sacroiliac screw trajectory length was 75.50 mm. The length of the screws was longer in men than in women, except for the S1A and SI screws, for which no difference was found between genders. Conclusion This study describes sacropelvic anatomical specifications. These defined morphometric details should be taken into consideration during surgical procedures.

Resumo Objetivo O objetivo deste estudo foi avaliar a antropometria sacropélvica da população portuguesa por meio de exames de tomografia computadorizada (TC). Métodos Quarenta TCs pélvicas foram analisadas para determinação do comprimento e ângulo das trajetórias definidas dos parafusos, como trajetória anterior (S1A), anterolateral (S1AL) e anteromedial (S1AM) do parafuso no pedículo de S1, trajetória anterolateral (S2AL) e anteromedial (S2AM) do parafuso no pedículo de S2 e trajetória ilíaca alar (S2AI), ilíaca e sacroilíaca (SI) do parafuso em S2. Comparações entre sexos também foram realizadas. Resultados O comprimento médio da trajetória S1A foi de 30,80 mm. O comprimento médio e o ângulo lateral de S1AL foram de 36,48 mm e 33,13°, respectivamente, e de S1AM, 46,23 mm e 33,21°. O comprimento médio e o ângulo lateral de S2AL foram de 28,66 mm e 26,52° e, de S2AM, 29,99 mm e 33,61°. O comprimento médio da trajetória ilíaca alar e os ângulos lateral e caudal do parafuso em S2 foram de 125,84 mm, 36,78° e 28,66°, respectivamente. O comprimento médio da trajetória ilíaca e os ângulos lateral e caudal foram 136,73 mm, 23,86° e 24,01°, respectivamente. O comprimento da trajetória sacroilíaca foi de 75,50 mm. O comprimento dos parafusos foi maior em homens do que em mulheres, à exceção dos parafusos S1A e SI, que não apresentaram diferenças entre os sexos. Conclusão Este estudo descreve as especificações anatômicas sacropélvicas. Esses detalhes morfométricos definidos devem ser considerados durante os procedimentos cirúrgicos.

Resumo Objetivo Historicamente, os resultados da artroplastia da primeira articulação metatarsofalângica (1MTP) eram relativamente ruins; no entanto, melhorias na compreensão da biomecânica normal do pé, nos materiais e no design dos implantes, tornam a artroplastia um tratamento aceitável em pacientes selecionados. O presente estudo pretendeu comparar os resultados clínicos e radiográficos da artrodese com os da artroplastia da 1MTP no tratamento de hallux rigidus e apresentar um racional para seleção de pacientes para artroplastia. Métodos Um total de 36 pacientes (38 pés) com hallux rigidus operados (12 artrodeses e 26 artroplastias) foram prospectivamente incluídos. A dor foi avaliada com recurso à escala visual analógica (VAS) e o resultado funcional usando a escala American Orthopaedic Foot and Ankle Society Hallux Metatarsophalangeal-Interphalangeal (AOFAS-HMI). As complicações e os resultados radiográficos foram também registrados e a taxa de sobrevida calculada para os dois procedimentos. Resultados Todos os pacientes referiram uma melhoria significativa na dor e nos resultados funcionais após a cirurgia. Os pacientes submetidos a artroplastia tiveram melhor resultado funcional na escala AOFAS-HMI (89,7 versus 65.7 pontos; p < 0.001) e melhor alívio da dor (VAS 1,6 versus 3,9 pontos; p = 0,002) quando comparados com os doentes submetidos a artrodese. Registrou-se um caso de infecção no grupo da artroplastia e 2 casos de pseudoartrose no grupo da artrodese. Conclusão A artrodese permite alívio da dor e resultados satisfatórios, mas altera a biomecânica da marcha. Tal como a artrodese, a artroplastia melhora a dor significativamente, sendo uma alternativa mais fisiológica para preservar a biomecânica do pé. Apesar dos dois tratamentos terem bons resultados clínicos, em pacientes selecionados, a artroplastia teve melhores resultados clínicos e menor taxa de revisão.

Abstract Objective Historical results of arthroplasty of the first metatarsophalangeal joint (1MTP) are relatively poor; however, improvements in the understanding of the normal foot biomechanics, implant materials and design currently make arthroplasty a reasonable option in appropriately selected patients. The present study aimed to compare the clinical and radiographic results of 1MTP arthrodesis and arthroplasty in the treatment of hallux rigidus and to present a rationale for patient selection for arthroplasty. Methods A total of 36 patients (38 feet) with hallux rigidus submitted to surgery (12 arthrodesis and 26 arthroplasties) were prospectively included in the study. Pain was assessed using the visual analogue scale (VAS) and the functional status was assessed using the American Orthopedic Foot and Ankle Society Hallux Metatarsophalangeal-Interphalangeal (AOFAS-HMI) scale. Complications and radiographic results were also analyzed, and survival rates were calculated for both procedures. Results All of the patients reported significant improvement in pain and functional status after surgery. Patients submitted to arthroplasty had better functional results on the AOFAS-HMI scale (89.7 versus 65.7 points; p < 0.001) and better pain relief (VAS 1.6 versus 3.9 points; p = 0.002) when compared with the group submitted to arthrodesis. There was one case of infection in the arthroplasty group and 2 cases of pseudarthrosis in the arthrodesis group. Conclusion Arthrodesis provides pain relief and satisfactory results but alters the biomechanics of gait. Like arthrodesis, arthroplasty improves pain significantly, being a more physiological alternative to preserve the biomechanics of the foot. While the two surgical methods yielded good clinical results, selected patients submitted to arthroplasty had better clinical scores and lower revision rates.

Objectivo: a espondilolise e a espondilolistese ístmica grau I são causas de lombalgia nos adolescentes e associam-se a fractura de fadiga da pars interarticularis por movimentos repetidos de hiperextensão. Na literatura não existe consenso quanto aos benefícios do tratamento cirúrgico nestes doentes, muitas vezes atletas, e a controvérsia prolonga-se sobre qual a melhor técnica cirúrgica. Os autores descrevem a técnica cirúrgica que sistematicamente utilizam e analisam os resultados obtidos. Material e métodos: retrospectivamente, entre 2004 e 2013, foram avaliados 30 adolescentes, 12 com lise ístmica e 18 com espondilolistese ístmica grau I, operados pelo mesmo cirurgião. A reconstituição ístmica foi feita com autoenxerto de ilíaco e fixação pedicular posterior temporária. Avalia-se a taxa de consolidação, complicações, dor (VAS), função (ODI) e o grau de satisfação. Resultados: a idade média foi 16.3 anos (13-18) e o seguimento 23.5 meses (14-48). Ocorreu consolidação em 100% dos casos. O VAS médio reduziu de 7.48 para 0.38 (p<0.0001) e, funcionalmente, o ODI médio melhorou de 38.55% para 1.59% (p<0.0001), de disfunção moderada para mínima. A todos os doentes foi retirado o material após 1 ano de reconstituição ístmica. No total, 63.3% dos doentes eram desportistas e todos retomaram o nível prévio. Não se verificou progressão da listese nem complicações significativas. Os doentes encontram-se satisfeitos e repetiriam o tratamento. Conclusão: as técnicas de artrodese obtêm bons resultados clínicos mas implicam perda de mobilidade segmentar e doença do nível adjacente. Comparativamente com técnicas dinâmicas, a técnica preconizada pelos autores permite não só a reconstituição ístmica eficaz como revela resultados superiores a médio prazo, o que supera a necessidade de segunda intervenção para extração do material. A reconstituição ístmica com autoenxerto e fixação pedicular posterior temporária na espondilolise ou espondilolistese ístmica grau I obteve excelentes resultados clínicos e elevada taxa de consolidação. Esta técnica é defendida pelos autores mesmo em atletas de alta competição.

Aim: the spondylolysis and grade I isthmic spondylolisthesis are causes of low back pain in adolescents. Both are associated with fatigue fracture of the pars interarticularis, induced by repeated hyperextension movements. In the literature there is no consensus about the benefits of the surgical treatment in these patients, often athletes, and the controversy extends to the best surgical technique to perform. The authors describe the surgical technique they systematically use and analyse outcome. Material and methods: from 2004 and 2013, retrospectively were analysed 30 adolescents, 12 spondylolysis and 18 grade I isthmic spondylolisthesis, operated by the same surgeon for a isthmic reconstruction with iliac autograft and temporary posterior pedicle fixation. The following parameters were evaluated: isthmus reconstitution, complications, pain (VAS), function (ODI) and patients’ satisfaction. Results: the mean age was 16.3 years (range 13-18) and follow-up 23.5 months (range 14-48). Consolidation occurred in 100% of cases. The VAS decreased from 7.48 to 0.38 (p<0.0001) and ODI improved from 38.55% to 1.59% (p<0.0001), moderate to minimal disability. The instrumentation was removed after one year post isthmic reconstitution in all patients. In total, 63.3% of patients were athletes and all of them returned to their previous competition level. There was no listhesis progression or significant complications. Patients are satisfied and would repeat treatment. Conclusion: the fusion techniques present good clinical results but are associated with loss of segment mobility and adjacent level disease. Compared with dynamic techniques, this technique recommended by the authors enables not only effective isthmic reconstitution as shows superior clinical outcomes in the medium term, which overcomes the need for second surgery to remove instrumentation. The isthmic reconstitution with autograft and temporary posterior pedicle fixation in spondylolysis or isthmic spondylolisthesis grade I obtained excellent clinical results and high rate of bone defect healing. The authors advocate this technique even in elite athletes.

Introdução: Para o desenvolvimento de terapêuticas celulares para o tratamento da degeneração do disco intervertebral é necessário o conhecimento detalhado das células que o constituem e das vias moleculares que levam à sua diferenciação. O núcleo pulposo (NP) embrionário, fetal e dos primeiros anos de vida é formado por células grandes e vacuoladas da notocorda; no entanto, com a maturidade esquelética, as células da notocorda desaparecem e são substituídas por células menores, semelhantes a condrócitos. Estudos animais e in vitro demonstraram que as células da notocorda exercem efeitos anabólicos e protetores sobre o disco intervertebral, pelo que o seu desaparecimento do NP humano tem sido implicado na patogénese da degeneração discal. Deste modo, o estudo destas células e dos seus mecanismos de regulação poderá identificar fatores envolvidos na homeostasia do disco intervertebral e ajudar no desenvolvimento de terapêuticas celulares para regenerar ou substituir as células do disco intervertebral degenerado. No entanto, o estudo de células da notocorda humana tem sido dificultado por restrições éticas, logísticas e técnicas, o que constitui uma importante limitação para o avanço científico nesta área. Este estudo foi realizado com o objetivo de isolar células da notocorda (precursoras do NP) das do esclerótomo (precursoras do anel fibroso (AF) e das vértebras) a partir de embriões e fetos humanos e caracterizar o seu fenótipo e os mecanismos ou moléculas reguladores da sua função no disco intervertebral. Métodos: Embriões e fetos humanos (3.5 a 12 semanas pósconceção) foram dissecados e caracterizados morfologicamente para confirmar a presença de células da notocorda na coluna vertebral em desenvolvimento. Uma vez que nesta altura do desenvolvimento humano não existe uma demarcação óbvia dos limites entre o NP, o AF e o corpo vertebral, foi desenvolvida uma estratégia baseada na identificação de um marcador celular específico para as células da notocorda e na sua utilização para as separar das células do esclerótomo. Para identificar esse marcador realizou-se uma pesquisa da literatura; seguidamente, os potenciais marcadores foram testados por imunohistoquímica em secções embrionárias e fetais contendo células da notocorda. Após identificação do marcador a usar, e uma vez que esse tinha localização intracelular, foi desenvolvida uma metodologia que permitisse extrair RNA a partir de um número limitado de células fixadas, permeabilizadas, marcadas com um anticorpo fluorescente e separadas por citometria de fluxo. O método desenvolvido foi então utilizado para separar e extrair RNA a partir de células da notocorda e esclerótomo fetais. A precisão da separação foi confirmada pela quantificação por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) da expressão de genes da notocorda nos dois tipos celulares separados. Posteriormente, microarrays foram utilizados para identificar o fenótipo e o software interactive pathway analysis (IPA®) foi utilizado para identificar moléculas e fatores reguladores da função das células da notocorda. Resultados: A coluna vertebral fetal humana foi validada como uma fonte adequada para obtenção de células da notocorda. A pesquisa da literatura identificou 16 potenciais marcadores específicos destas células e a validação de um grupo deles identificou as moléculas KRT8, KRT18 e KRT19 como sendo específicas para as células da notocorda da coluna vertebral fetal humana. Verificou-se que uma metodologia consistindo na fixação e permeabilização de células com 95% etanol/ 5% ácido acético, marcação com um anticorpo fluorescente anti-KRT18 e separação por citometria de fluxo permitia obter RNA de elevada qualidade. Esse método foi utilizado para separar células extraídas enzimaticamente da coluna fetal humana e separar as células da notocorda (precursoras do NP e KRT18-positivas) das células do esclerótomo (precursoras do AF e das vértebras e KRT18-negativas). A maior expressão diferencial dos genes da notocorda KRT18, KRT19, brachyury, Galectin 3, CTGF e FOXA2 pelas células KRT18-positivas confirmou a precisão da separação. A análise dos dois tipos celulares por microarrays identificou 782 genes regulados positivamente e 678 regulados negativamente pelas células da notocorda. A análise IPA identificou 30 moléculas reguladoras dos genes expressos pelas células da notocorda. Destas, o hepatocyte growth fator (HGF) foi identificado como o principal fator de crescimento a montante das células da notocorda ativando genes importantes para a sua função no disco intervertebral. Discussão: Este estudo isolou pela primeira vez células da notocorda humana. Para o realizar foi desenvolvida uma metodologia complexa, cujas aplicações se estendem para lá desta área de investigação. A análise por microarrays identificou marcadores fenotípicos das células da notocorda, alguns dos quais potencialmente responsáveis pelos seus efeitos protetores no disco intervertebral. O fator de crescimento HGF foi identificado como um regulador destas células, podendo ser responsável por algumas das funções que lhes são atribuídas.

Introduction: For the development of cell-based therapies targeting intervertebral disc (IVD) degeneration a thorough understanding of its cells and the molecular pathways leading to their differentiation is required. The embryonic, foetal and juvenile nucleus pulposus (NP) is populated by large vacuolated notochordal cells that with skeletal maturity become replaced by smaller chondrocyte-like cells. Since animal and in vitro studies have shown that notochordal cells display protective and anabolic roles in the IVD, their loss in humans has often been suggested to initiate the degenerative process. As such, a detailed understanding of these cells and their regulatory pathways may help to identify factors involved in IVD homeostasis and the development of novel cell-based therapies targeting disc degeneration. The study of human notochordal cells has however been hindered by ethical, logistical and technical restrictions in obtaining suitable samples, which constitutes a major limitation to the field. This study was conducted with the objective of isolating notochordal cells (precursors of the NP) from their adjacent sclerotomal tissues (precursors of the annulus fibrosus (AF) and vertebrae) from human embryonic and foetal spines and to identify their phenotype and potential factors involved in their function in the IVD. Methods: Human embryonic and foetal spines (3.5-12 weeks post-conception) were dissected and characterised morphologically to confirm their suitability as sources of notochordal cells. Then, and since there was no visible demarcation between the NP, AF and vertebral regions, a strategy involving the identification of a notochord-specific marker to label and sort notochordal cells was devised. To identify a notochordspecific marker, a literature search was performed followed by the validation of identified putative markers in the human foetal spine using immunohistochemistry. Subsequently, and as the identified marker had an intracellular location, a novel methodology was developed to allow for the extraction of high quality RNA from limited numbers of fixed, permeabilised, labelled with a fluorescent antibody and sorted cells. Using the optimised methodology, RNA was extracted from notochordal and sclerotomal cells. Separation accuracy was validated using real time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) for known notochordal markers. Microarrays were then used to identify differentially expressed genes between notochordal and sclerotomal cells and interactive pathway analysis (IPA) was used to identify notochordal cell regulators. Results: The human foetal spine was validated as a suitable source of notochordal cells. The literature search identified 16 putative markers and the validation of a panel of these identified KRT8, KRT18 and KRT19 as human notochord-specific markers. A methodology involving cell fixation and permeabilisation using 95% ethanol/ 5% acetic acid, followed by incubation with a directly conjugated KRT18 antibody and separation by fluorescence activated cell sorting was found to have no detrimental effect on the RNA quality. This method was therefore used to separate enzymatically obtained human foetal notochordal cells (NP precursors and KRT18-positive) from sclerotomal cells (AF and vertebrae precursors and KRT18-negative). qRT-PCR analysis validated the cell separation methodology by confirming that notochordal cells had higher differential expression of the notochordal markers KRT18, KRT19, brachyury, Galectin 3, CTGF and FOXA2. Array analysis identified 782 upregulated and 678 downregulated genes. IPA analysis identified 30 upstream regulators of notochordal cell genes. Of these, hepatocyte growth factor (HGF) was the top growth factor and was predicted to be activating a number of relevant notochordal genes. Discussion: This study isolated, for the first time, human notochordal cells. To do so, a complex labelling methodology was devised that is applicable to different areas of research. Microarray analysis identified a list of notochordal cell markers, some of which may be important in notochordal cell function within the IVD. Importantly, HGF was identified as an upstream regulator of notochordal cells that may be involved in some of the biological functions attributed to them.